为什么进行HBV基因型及耐药基因突变检测？

1. 乙型肝炎病毒（HBV）小知识

乙型肝炎病毒(HBV)的复制效率很高，每天可产生万亿级（1012～1013）个病毒颗粒，较丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）分别高10倍和100倍。HBV复制过程主要通过HBV聚合酶进行，这是一种逆转录酶，由于其缺乏校正能力，错配率较高，所以在同一患者体内的HBV构成并不均一，而是由基因序列存在差异的多种病毒株组成，这些序列不同的病毒群称为准种（Quasispecies）。

2. 为什么进行HBV基因型检测？

 上述HBV不同准种间，若核苷酸序列异源性大于8%或S基因区异源性大于4%,就形成不同的基因型。HBV至少有9 个基因型（A-J），我国以B型和C型为主。HBV基因型与疾病进展和干扰素(IFN-α)治疗应答有关，与C基因型感染者相比，B基因型感染者较少进展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HBeAg阳性患者对干扰素（IFN-α）治疗的应答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型。病毒准种可能在HBeAg血清学转换、免疫清除以及抗病毒治疗应答中具有重要意义；同时，HBV-B型、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。

3. 为什么进行HBV耐药基因突变检测？

a. HBV耐药是怎样产生的？

目前我国用于治疗慢性乙型肝炎的核苷（酸）类药物（NAs）主要有5种：拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韦（ETV）和替诺福韦酯（TDF）等，其作用靶点均为病毒聚合酶基因(位于HBV基因P区)。若该基因的逆转录酶区（RT区）及其编码的氨基酸发生突变，会导致突变的病毒株对治疗药物的敏感性下降，药物对乙型肝炎病毒的抑制作用下降或消失。在长期应用某一抗病毒药物的情况下，野生株被抑制，当生存下来的突变株占主导时，此种药物便失去了抗病毒疗效，从而导致耐药的发生。

b. 常见NAs抗病毒药物的耐药率如何？

由于不同NAs的抗病毒效力和耐药基因屏不同，这些药物长期治疗的耐药率差异显著。根据现有临床试验数据，对于初治慢性乙型肝炎患者，LAM治疗５年的耐药率高达70％；LdT治疗2年，HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者的耐药率分别为25％和11％;ADV治疗5年，HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者的耐药率分别为20%和29%；ETV治疗5年的耐药率为1.2％；TDF治疗8年的临床资料显示，尚未检测到相关的耐药位点突变。

c. 耐药产生的不良后果有哪些？

与未发生HBV耐药患者比较，耐药不仅可使已取得的治疗效果（如HBVDNA转阴、转氨酶复常、组织学改善等）丧失，还可能导致肝脏病变急剧恶化，使疾病加速进展为肝衰竭，增加肝移植率、肝癌发生率和病死率。同时，交叉耐药、多药耐药等使后续治疗方案变得更为复杂和困难，并可能增加发生终末期肝病的风险。

d. 耐药检测的作用及意义？

检测HBV耐药基因突变的意义为：①在治疗过程中检测，有助于及时发现基因型耐药，从而采取预防措施，避免发生病毒反弹；② 耐药发生后检测，可根据耐药情况及时换药、加药或更改治疗方案，使患者获得更好的治疗效果。

HBV基因型及耐药突变检测方法

1. 目前HBV基因型常用的检测方法有哪些？

PCR产物直接测序法、PCR-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）、ELISA法；基因芯片技术、实时荧光PCR法等。

2. 目前HBV耐药突变常用的检测方法有哪些？

PCR产物直接测序法、PCR产物克隆测序法、限制性片段长度多态性技术（RFLP）、线性探针反向杂交法（INNO LiPA）、基因芯片技术、限制性片段质谱多态性分析、焦磷酸测序法和深度测序法等。

3. 本检测中心采用的是什么方法？

本检测中心采用的是PCR产物直接测序法，即采用PCR结合测序技术,对HBV基因P区进行扩增及测序，获得核苷（酸）类药物相关耐药位点的变异信息，从而分析病毒变异情况。

同时，本中心按照国际惯例，将扩增的S区基因产物与国际基因库中HBV的标准序列进行比对，通过亲缘树分析，确定患者HBV基因型。

4. 本中心采用的耐药突变检测方法有哪些优势？

本检测中心所用方法是目前最常用的、基因型耐药检测经典方法之一，具有如下优点：

①高覆盖度, 灵敏准确：野生型背景中能测出所有突变位点，包括可能的代偿性突变和新突变位点片段检测

②抽血量少，高效可靠：血清或血浆，只需20ng 核酸；最少量反应中完成多个检测

③流程可靠，结果可信：其中3500DX测序仪获得SFDA认证。

进行基因耐药突变检测有哪些注意事项？

1. HBV耐药基因突变检测标本采集及出报告时间

病人采集静脉血2ml（用EDTA-K2抗凝）送检验部分子诊断学实验室，7个工作日出报告。

2. HBV耐药突变检测建议

①原发无应答、部分病毒学应答或病毒学突破的患者，应进行耐药位点检测，有助于指导治疗方案的调整。

原发性无应答：在依从性良好的情况下，用NAs治疗3个月（12周）时，HBVDNA下降＜1 lgIU／ml。

部分病毒学应答:在依从性良好的情况下，治疗至6个月（24周）时，仍能检测到HBVDNA，但下降＞1 lgIU/ml。

注：判定部分病毒学应答的时间因NAs类别而异，对于低耐药基因屏障NAs，如拉米夫定和替比夫定，判定时间为6个月（24周），而对于高耐药基因屏障NAs，如恩替卡韦和替诺福韦，判定时间推荐为12个月（48周）。

病毒学突破：在未更改治疗方案的情况下，获得部分或完全病毒学应答

（HBVDNA低于检测下限）的患者，其HBVDNA水平较治疗中最低点上升１lgIU/ml，并在间隔1个月以上的第2次检测证实。

②复发、耐药或其他原因再治疗的ＮＡｓ经治患者，应进行耐药位点检测，以确定突变模式，进行针对性治疗。