为什么进行HCV基因型及DAAs耐药相关变异检测？
1. 丙型肝炎病毒（HBV）小知识
丙型肝炎病毒(HCV)的复制效率很高，每天可产生万亿级（1012）个病毒颗粒。HBV复制过程主要通过RNA依赖性RNA聚合酶进行，该酶缺乏校正能力，错配率较高，所以HCV在感染宿主后，很容易发生变异。这意味着感染一段时间后，每个HCV感染者体内就会同时存在由多种不同序列组成的、但具有很高同源性的HCV变异株群体，称为准种（Quasispecies）。
2. 为什么进行HCV基因型检测？
上述HBV不同准种间，若核苷酸序列异源性大于30%,就形成不同的基因型,若核苷酸序列同源性在70-85%之间，就归为同一基因型的不同亚型。HCV有6个基因型（1-6）和80多种基因亚型。HCV 1b和2a基因型在我国较为常见，其中以1b型为主（56.8%），其次为2型（24．1%）和3型（9.1%），未发现基因4型和5型，6型相对较少（6.3%）。HCV基因型及亚型的检测是目前抗病毒治疗方案的基础， 通过分型检测，可指导聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，或直接抗病毒药物（DDAs）等临床治疗方案的制定，有针对性进行临床治疗，最大程度上提高抗病毒疗效。抗HCV治疗前必须进行HCV基因型及亚型测定。
3. 为什么对HCV进行DAAs耐药相关变异检测？
a. 什么叫DAAs耐药相关变异？
直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents, DAAs）的问世是HCV治疗史上的一次革命，其对HCV清除的有效率达到90%以上，并减少了治疗的禁忌证和不良反应，给难治性HCV感染患者、存在干扰素和利巴韦林治疗禁忌证或不能耐受的患者等特殊人群带来了新的希望。根据DAAs作用于HCV的不同蛋白部位，可以将其分为非结构蛋白（non-structural, NS）3/4A 蛋白酶抑制剂（simeprevir）、NS5A抑制剂（例如ledipasvir、daclatasvir等）、NS5B聚合酶抑制剂（sofosbuvir）等。如果一些HCV准种突变发生在DAAs药物的靶点基因上，其中某些特定的突变就会引起DAAs的敏感性下降,故称为DAAs耐药相关变异（Resistance-associated variants ，RAVs）。这种变异既可以自然发生，也可以在DAAs治疗后，在药物的选择压力下产生。
b. 为什么进行DAAs耐药相关变异（RAVs）检测？
DAAs 耐药相关变异的存在，可以显著降低DAAs的治疗效果-尤其是当应用
基因耐药屏障相对较低的NS3/4A蛋白酶抑制剂和NS5A抑制剂进行治疗时。对之进行及时、准确检测,可以指导DAAs药物选择，增加疗效。例如由美国Gilead公司生产的知名神药Harvoni(由ledipasvir和sofosbuvir两种成分组成)，是第一个被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准的、用于治疗慢性基因1型HCV 感染的二联复方片剂，也是第一个被批准不需要给予干扰素或利巴韦林的方案。由于该药疗效好，在印度等国家价格低廉，国内很多丙肝患者通过各种途径购买后使用。然而研究显示，对于Harvoni应用8周或12周治疗失败、未取得SVR的42例HCV感染患者，当再次使用Harvoni进行24周的长疗程治疗时，若患者体内HCV未检出针对NS5A抑制剂ledipasvir的耐药相关变异，则可取得100%(11/11)的疗效；当存在相应变异时，只有60%（18/30）患者可取得HCV清除（SVR12），并且在25%（3/12）的再次治疗失败患者中，发现了sofosbuvir相关的耐药突变S282T。考虑到国内患者在早期难以获得harvoni等“吉二代”药物，相反更多的是从印度等国购得“吉一代”产品sofosbuvir，且无论治疗什么基因型HCV，很多患者均应用Sofosbuvir单药联合或不联合利巴韦林治疗。虽然有报道称sofosbuvir相关RAVs在体内消失的较快，但其滥用导致的耐药仍可能为随后的治疗带来极大困难。
总结检测HBV耐药基因突变的意义为：①在治疗前检测，有助于及时发现基因型耐药，从而指导抗病毒药物选择和治疗方案制定；② 耐药发生后检测，可根据耐药情况，下次再次治疗做到正确换药、加药或更改治疗方案，使患者获得最好的治疗效果。
HBV基因型及耐药突变检测方法
1. 目前HCV基因型常用的检测方法有哪些？
HCV基因分型的方法有分子生物学和血清学两大类，前者包括PCR产物直接测序法DNA测序法、型特异性引物扩增法、基因芯片、探针杂交等，后者是合成HCV特异性多肽来检测其特异性的抗体从而区分基因型，但不能区分亚型。
2. 目前HCV耐药相关变异常用的检测方法有哪些？
目前检测耐药相关基因突变的方法有DNA测序法，包括PCR产物直接测序法、新一代深度测序方法，以及体外表型分析法，即测定抑制病毒复制所需的药物浓度如EC50或EC90。目前已确认的耐药相关突变位点主要有：① NS3/4A靶点相关：V36M、T54A、Q80K、R155K、 A156T和D168V；② NS5A靶点相关：M28T、Q30E/H/R、L31M、H58D和 Y93H/N；③ NS5B靶点相关：S282T、C316N/H/F、M414T 、A421V、P495L/S和S556G等
3. 本检测中心采用的是什么方法？
本检测中心采用的是PCR产物直接测序法，即采用PCR结合测序技术,对HCV NS3/4A、NS5A、NS5B等基因进行扩增及测序，获得相应DAAs药物相关耐药位点的变异信息，从而分析病毒变异情况。
同时，本中心按照国际惯例，将扩增的NS5B区基因产物与国际基因库中HBV的标准序列进行比对，通过进化树结构分析，确定患者HCV基因型。
4. 本中心采用的耐药突变检测方法有哪些优势？
本检测中心所用方法是目前最常用的、基因型耐药检测经典方法之一，具有如下优点：①高覆盖度, 灵敏准确：野生型背景中能测出所有突变位点，包括可能的代偿性突变和新突变位点片段检测; ②抽血量少，高效可靠：血清或血浆，只需20ng 核酸；最少量反应中完成多个检测；③流程可靠，结果可信：其中3500DX测序仪获得SFDA认证。
进行HCV基因型及DAAs耐药相关变异检测有哪些注意事项？
1. 检测标本采集及出报告时间
病人采集静脉血2ml（用EDTA-K2抗凝）送检验部分子诊断学实验室，7个工作日出报告。
2. 检测建议
① 既往未曾接受过抗病毒治疗，目前拟应用DAAs抗病毒治疗的患者。尤其是基因1a型，拟利用含simeprevir抗病毒治疗的患者，需检查是否存在NS3蛋白酶序列Q80K变异；拟应用 elbasvir/grazoprevir，需要检测NS5A相关耐药。对于基因3型患者，当考虑用sofosbuvir/velpatasvir 或 daclatasvir/sofosbuvir治疗时，推荐NS5A RAV检测。
② 既往曾应用长效干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗失败的患者。
③复发、耐药或其他原因再治疗的DAAs经治患者，应进行耐药位点检测，以确定突变模式，进行针对性治疗。